【资料图】

多肽分子是由多个氨基酸通过肽键（酰胺键）连接而形成的化合物，其有以下几个特点： 多肽药物分子量较大，如多肽类明星药物索马鲁肽（司美格鲁肽）分子量为 4114Da ，虽低于大分子药物，但分子量是小分子药物的数倍。分子量的增加使其在色谱行为上有了一些重要的变化，如其对溶剂强度更加敏感， B% 的微小变化会引起保留时间的快速变化，另外其在流动相中的扩散也更慢，会导致柱效的降低和峰宽的增加 ²； 多肽分子存在高级结构。多肽链通过 α 螺旋和 β 折叠等方式形成二级结构和三级结构，有其特殊的三维结构形式。由于分子体积和三维结构，使得所有的氨基酸不会同时接触固定相，只有位于表面的残基才可以产生相互作用； 多肽分子通过酰胺键相连，酰胺键有部分双键性质，互变的顺反异构体可能会使峰型变差； 多肽分子为两性分子，具备酸性基团羧基和碱性基团氨基，有其特定的等电点。 多肽药物杂质谱十分复杂，如 CDE 发布的《合成多肽药物药学研究技术指导原则》（以下简称指导原则）中提到的，合成多肽分子有多种类型的工艺杂质和降解杂质，特别是差相肽杂质的结构和性质与主成分非常接近，色谱行为也相近，大大增加了分离分析的难度。 针对多肽分子上述特点，其在有关物质分析方法开发上也有一些特殊之处。多肽药物有关物质分析的常用方法是高效液相色谱法，可采用反相色谱、离子交换色谱和体积排阻色谱等模式。 1反相色谱法（RP）： 1.1 色谱柱的选择：上文中提到的多肽分子在流动相中扩散慢的特点，在色谱柱选择时需要找着重考虑。

硅胶载体机械强度高，技术成熟稳定，可选择性高；

由于多肽分子缓慢扩散的特点，在表面多孔型硅胶颗粒上，溶质分子只进入颗粒表面的硅胶层，在颗粒中走过的路径更短，减少了颗粒内部扩散，因此在该类型颗粒上引起的谱带展宽更小，见图1。小粒径色谱柱也有助于解决谱带展宽和柱效降低的问题，虽然粒径越小，柱压会大大提高，但多肽分子在粒径减小上的收益要高于小分子化合物。同样，选择窄径柱也减少在色谱柱纵向扩散时的谱带展宽。

图13，全多孔与表面多孔颗粒传质路径对比

常见的10nm，12nm孔径的色谱柱可以满足大多数多肽的分析，允许多肽分子进入颗粒内部孔隙。

烷基键合相，特别是C18是目前最常用的固定相类型，同样用于多肽药物的分析，但各种类型的苯基柱可提供不同的选择性，特别是对含有酪氨酸等芳香结构残基的多肽。另外一些表面修饰，封端/不封端，嵌合基团的色谱柱也可提供不同的选择性。

目前市场上有诸多厂家，不同工艺和类型的反相色谱柱，品类繁多，而在方法探索阶段需要尝试不同选择性的色谱柱，可借鉴一些表征方法，如使用H、S、A、B、C参数的Snyder/Dolan法，或通过USP或供应商网站查找选择性差异大的色谱柱；另外使用自动化、智能的方法开发软件可大大节约开发时间，更适用于多肽有关物质方法开发。

1.2 流动相的选择： 三氟乙酸是多肽分析时常用的缓冲液，有良好的缓冲能力，且和多肽的氨基形成离子对作用，增加保留，常用浓度为 0.1% （ V/V ）； 磷酸盐是最常用的反相色谱缓冲盐，可以配置成不同的 pH ，高浓度的磷酸盐如 50mmol/L 可以提供较高的离子强度，减轻因多肽分子相互排斥造成的峰型展宽；离液剂如六氟磷酸盐和高氯酸钠等，不仅可以提高离子强度，改变选择性，且在乙腈水中的溶解度更高。 多肽做为两性物质，流动相 pH 的变化对分离有深远的影响，因此 pH 的筛选非常重要；需要注意的是多肽分子在等电点附近溶解度最低，应避开等电点 pH 至少 ±1.0 个单位。 乙腈作为有机相（ B% ）有其明显的优点，紫外吸收低，粘度低，峰型优于醇类溶剂等。醇类溶剂（甲醇、异丙醇），可以少量加入提供不同的选择性； 前文中提到多肽分子对有机相 B% 敏感，微量变化可以导致保留时间明显改变，因此需要设置梯度程序时需缓慢增加 B% ，达到最佳分离； 1.3 其他色谱参数： 高柱温降低流动相粘度，提高分子扩散速度，改善峰型，以及选择性的变化，提高分离度，还能解决顺反互变异构峰型差的问题，这也是多肽分析的一个特点，如图 2 的案例。需要注意的是如果使用高柱温需要对柱前流动相进行预热 ²，高柱温也有一些缺点，如样品降解和色谱柱寿命下降。 图 2²柱温对多肽分子分离度的影响 多肽缺少共轭结构，一般选择末端吸收波长 210nm~220nm ，即酰胺键的吸收；虽然有些多肽含苯丙氨酸等芳环侧链的氨基酸，但吸收强度明显低于末端吸收。 保证稀释液的 pH 和溶剂强度与初始流动相相同或接近，避免产生溶剂效应； 超高效液相色谱仪是多肽药物分析的首选，部分高效液相也可能满足性能要求。 2离子交换色谱法（IEC）：由于多肽药物有丰富的杂质谱，很多时候仅仅使用反相色谱无法满足杂质分析研究的目的，离子交换色谱法提供了不同的分离选择性，可以作为反相色谱法的有效补充。 2.1 流动相的选择： u 缓冲液调控流动相 pH ，进而改变样品的电离程度，影响保留和选择性。对于多肽药物，流动相 pH 一般至少控制在等电点 ±1 个 pH 单位。阳离子交换流动相 pH 至少低于等电点 1 个 pH 单位；阴离子交换，流动相 pH 至少高于等电点 1 个 pH 单位；缓冲液可选用反相色谱的常见种类，但磷酸盐仍是首选。 u 反离子在 IEC 中发挥着重要作用，其种类和浓度用于调控保留和选择性；阴离子： Cl^-等卤负离子、 ClO₄^-、 SO₄^2-；阳离子： Na⁺等碱金属离子；如果具备流动相选择的软件，则省时省力。 u 有机溶液：乙腈仍是首选，影响峰型和选择性； 2.2 色谱柱的选择： u 载体可选择硅胶，但要保证 pH 的耐受性，许多色谱柱厂家也提供聚合物载体； u 规格参考反相色谱法的建议； u IEC 固定相一般有以下四种：强阴离子交换 -N(CH3)₃⁺；强阳离子交换 -SO₃^-；弱阴离子交换： -NH₂；弱阳离子交换： -COOH ； 2.3 其它色谱参数：可参考反相色谱。 3尺寸排阻色谱法（SEC）：常用于多肽药物中聚合物杂质的分离，根据聚合物分子与药物分子体积的不同进行分离。 3.1 色谱柱：填料选择硅胶表面采用硅烷醇（二醇基柱）修饰，以降低硅胶与多肽分子的作用。一般厂家推出的 12nm 孔径 SEC 柱可满足多肽聚合物的分离。色谱柱规格没有反相色谱柱多，可选较较小粒径。 3.2 流动相： u 缓冲液：可选常用的三氟乙酸、磷酸缓冲液，调控 pH 和离子强度减少离子化作用，根据需要可使用较高浓度； u 有机溶剂：乙腈或甲醇，减少疏水作用； u 流速：常用 1ml/min ，但由于多肽分子扩散系数低，可用较低流速以提高柱效。 小结多肽药物有关物质分析方法开发难度大，周期长。正如指导原则中所述，需要摸索多种分离模式，以及每个模式下的各种参数，如不同固定相的色谱柱，不同流动相 pH 等等，随着杂质研究工作的推进还需不断优化各个参数。基于以上特点，多肽药物有关物质方法开发是一个系统性，技术性的高难度工作，需要方法开发人员不断学习，在实践中加深对分子特性和分离原理的了解，最后还要保持足够的耐心和信心。 参考文献

[1] CDE.《化学合成多肽药物药学研究技术指导原则（试行）》.2023年2月

[2]Snyder,L.R.等著.陈小明等译.《现代液相色谱技术导论（第3版）》.2012年

[3]安捷伦科技（中国）有限公司.《多肽类药物分析策略PPT》

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